Ультраструктурная визуализация срезов ткани больших площадей становится возможной благодаря новой, более быстрой методике с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Электронная микроскопия — незаменимый инструмент патологоанатома. Она обеспечивает визуализацию тканевых структур, клеток, органелл и микробов в высоком разрешении. Однако ультраструктурный анализ больших участков ткани может оказаться сложным и трудоёмким.
Мы побеседовали с доктором Майком Райхельтом, главным научным сотрудником американской корпорации «Генентек» (Genentech, Inc.). Доктор Райхельт отвечает за рутинную работу лаборатории электронной микроскопии в отделении патологической анатомии. Помимо этого, доктор Райхельт разрабатывает и внедряет инновационные стратегии для научно-исследовательской организации корпорации «Генентек».
Недавно доктор Райхельт совместно с коллегами опубликовал статью (англ.), в которой описал эффективную технологию визуализации срезов ткани больших площадей с помощью обратно-рассеянных электронов (BSE-SEM) для визуализации ультраструктур в патологической анатомии.
Доктор Майк Райхельт, главный научный сотрудник корпорации «Генентек» (США)
Что побудило вас разработать новую технологию визуализации срезов ткани больших площадей?
У нас в отделении патологической анатомии возникла острая потребность в анализе здоровых и поражённых тканей как на гистологическом, так и на ультраструктурном уровне. Мне удалось разработать стратегию (англ.), ориентированную на подготовку больших, площадью в несколько квадратных миллиметров, срезов ткани с акцентом на получение широкоформатных изображений. Это позволяет легко сопоставлять гистологические исследования с малым увеличением с ультраструктурными особенностями с высоким разрешением в пределах одного среза ткани.
Клубочек почки мыши в центре, окружённый различными почечными канальцами.
Вы используете обратно-рассеянные электроны в сканирующем электронном микроскопе. Не могли бы вы рассказать, что побудило выбрать такой нестандартный метод?
Традиционно анализ тканей на ультраструктурном уровне чаще всего проводится с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ). Несмотря на то, что подобный метод используется уже несколько десятилетий и пользуется большим успехом, он отнимает много времени и создаёт немало помех:
- Малый размер ТЭМ-сеток ограничивает размер среза ткани.
- Решетки сетки создают ещё больше ограничений и затемняют поле обзора.
- Подготовка ультратонких срезов требует специальной подготовки и квалифицированного персонала.
- Корреляция ТЭМ изображений с большими увеличениями областью интереса исследуемого образца, определенной оптической микроскопией, может оказаться чрезвычайно сложной и трудоёмкой задачей.
Эти ограничения можно устранить при визуализации тканей с помощью современных автоэмиссионных сканирующих электронных микроскопов (автоэмисионных СЭМ) в сочетании со стратегиями обработки образцов, позволяющими подготавливать большие срезы ткани (площадью в несколько квадратных миллиметров). Наша новая технология в полной мере использует преимущества очень больших полей сканирования, возможных с помощью современных автоэмисионных СЭМ. Они позволяют получать большие обзорные изображения и исследовать их на ультраструктурном уровне путём цифрового масштабирования.
Цифровое масштабирование: от обзора ткани почки до обзора клубочка (кл). Правая сторона: подоцит (пц) с цветоножками (цн), базальной мембраной (бм) и капиллярным пространством (кп) с эритроцитами (эц).
Практически 100% всех проектов по ультраструктурной визуализации тканей (не менее 20 проектов в год) в настоящее время выполняются с применением электронного микроскопа ZEISS GeminiSEM 300. С тех пор как в 2018 году этот метод был внедрен в нашу работу, он уже внес свой вклад в четыре опубликованные научные статьи, рецензируемые нашими коллегами. Также в настоящее время готовится немало других работ наших научных сотрудников.
Что касается новых методов и технологий, каким вы видите развитие этой области в ближайшие пять лет?
Хотелось бы выделить три наиболее значимые разработки в области ультраструктурной визуализации на ближайшие пять лет, имеющие отношение к исследовательской патологической анатомии в биотехнологической промышленности:
1. Первая разработка
Внедрение эффективных корреляционных технологий, сочетающих в себе преимущества методов иммунофлуоресцентной микроскопии для молекулярной характеристики типов клеток, органелл и для решения задачи доставки лекарственных средств или локализации терапевтических молекул с преимуществами метода электронной микроскопии для обеспечения ультраструктурного разрешения.
Несмотря на то, что в литературе встречаются описания нескольких стратегий корреляционной микроскопии, основные проблемы по-прежнему остаются нерешёнными. К ним можно отнести разработку оптимизированных методов пробоподготовки тканей, которые сохраняли бы как антигены, так и флуоресцентную метку белка в сочетании с превосходной ультраструктурой и контрастом мембран, а также внедрение простых технологий для получения и корреляции изображений оптической и электронной микроскопии.
ZEISS ZEN Connect, ZEISS Shuttle & Find и ZEISS Atlas — то, что нужно для достижения этих целей.
Пример корреляционной иммунофлуоресцентной и электронной микроскопической визуализации с помощью программного обеспечения ZEISS Shuttle & Find. Наложение двух изображений очень хорошо показывает синее окрашивание ядер и зелёную флуоресценцию подокаликсина над подоцитами, которые полностью отображаются с помощью СЭМ. Оптическомикроскопические изображения получены с ZEISS Axio Imager 2, а электронномикроскопические — с ZEISS GeminiSEM 300.
2. Вторая разработка
Интерпретация, количественная оценка и анализ данных ультраструктурной визуализации будут значительно ускорены с помощью машинного обучения и искусственного интеллекта. Благодаря им станет возможна автоматическая сегментация ультраструктурных элементов (например, органелл).
3. Третья разработка
Исследователи будут всё чаще запрашивать 3D-массивы данных для более исчерпывающих оценок и анализов. Я полагаю, что упорядоченная томография серийных срезов, совместимая с корреляционной иммунофлуоресцентной и ультраструктурной визуализацией, а также серийная визуализация больших объёмов тканей ( ZEISS 3View, RMC Boeckeler ATUMtome) будут наиболее актуальны для нашей лаборатории электронной микроскопии.
Ранее основной проблемой методов объёмной электронной микроскопии была чрезвычайно трудоёмкая сегментация больших наборов данных изображений, из-за чего эти методы были не очень актуальны в биотехнологической промышленности, где инновации должны сочетаться с эффективностью и высокой автоматизацией.
Однако учитывая прогресс, достигнутый за последние годы в области разработки автоматизированных методов сегментации, эта задача, по-видимому, быстро решится, вследствие чего электронная микроскопия больших объемов также станет приобретать всё большее значение.
Дополнительная информация
Полный текст статьи с описанием метода доктора Райхельта.
Статьи, в которых описано, как доктор Райхельт реализовал этот метод: