От идеи до реализации: лантаноидный контраст для биологических исследований в НИИ глазных болезней

Растровый электронный микроскоп (РЭМ) принято считать основным инструментом материаловедов. Тем не менее, все чаще он становится незаменимым и мощным помощником ученых в биологических и медицинских исследованиях.

Меняются и совершенствуются технологии, работа с биологическими объектами становится все более удобной, а методы разнообразнее. Появляются новые возможности, а значит и конкурентных преимуществ у научных групп, использующих РЭМ для биологии, становится больше.

В ФГБНУ «НИИ глазных болезней» сканирующий электронный микроскоп ZEISS EVO появился несколько лет назад. Группа электронной микроскопии лаборатории фундаментальных исследований НИИ ГБ осуществляет фундаментальное сопровождение прикладных научных тем института. Сотрудники лаборатории не только освоили все возможности прибора, но и разработали собственные оригинальные методы контрастирования биологических объектов, которые открывают совершенно новые перспективы для электронной микроскопии в биологии.

О работе в лаборатории мы поговорили с Иваном Новиковым, руководителем группы электронной микроскопии в лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ «НИИГБ».

В работе с биологическими объектами вы используете собственные методы контрастирования, скажите, для чего это нужно?

Дело в том, что в самом простом случае электронная микроскопия для биологических объектов не дает той эффективности, которая сделала ее популярным методом в материаловедении. А именно — сочетания простоты применения и информативности. Биологические объекты требуют сложной и долгой пробоподготовки. Например, чтобы увидеть поверхность, производят напыление тонких металлических пленок, либо уходят в область низких ускоряющих напряжений и применяют массу других ухищрений. Но, как правило, исследование биологических объектов все равно сводится к изучению микроструктуры поверхности, а интересно было бы проникнуть внутрь клетки. Стандартные методы становятся бессильными для решения этой задачи.

Например, наш электронный микроскоп оснащен детектором обратно-рассеянных электронов, он позволяет смотреть сверху на как бы полупрозрачный биологический объект. Но для проведения таких наблюдений необходимо сделать контрастными отдельные элементы биологических объектов. В обратно-рассеянных электронах контрастность приобретают объекты с различным атомным номером. Поэтому нам нужно было решить фундаментальную задачу: как на уровне ультраструктуры биологических образцов насытить отдельные элементы этой ультраструктуры неким тяжелым химическим элементом с высоким атомным номером. Известно, что кальций очень охотно меняется на редкоземельные элементы группы лантана (лантаноиды), если они есть в системе. Когда к нам пришла идея заменить кальций лантаноидами, в течение года мы вместе с группой клеточных технологий разрабатывали систему, которая позволяет насыщать биологические объекты по так называемой суправитальной схеме. Это означает, что пока они еще живые, мы заставляем метаболизировать тяжелые элементы. Когда нам это удается, биологические объекты становятся контрастными в обратно рассеянных электронах и полупрозрачными под электронным пучком.

ММСК из пульпы молочного зуба на 3D скаффолде Alvetex. Хорошо видно расположение клеток на ребрах пористой структуры материала: они растягиваются по поверхности и перекидываются с одной стороны поры на другую. В структуре клеток легко различается ядро, прикрытое сетью ЭПР, тяжи цитоскелета и выросты мембраны, которыми клетка «держится» за подложку. Кое-где можно разглядеть яркие точки в толще клеток — митохондрии. Для контрастирования использован хлорид неодима

Это универсальный метод?

Когда мы придумывали этот метод, то задумывали его как универсальный. Но самые выгодные объекты для наблюдения на настоящий момент — это, пожалуй, животные клетки на пластике и различные эпитализированные поверхности. Как я уже отмечал, элементы группы лантана очень хорошо замещают кальций, а все белки межклеточной адгезии и якорные белки имеют кальций-зависимые элементы. Когда мы меняем кальций в этих эпителиальных тканях на лантан, границы клеток и межклеточные контакты начинают очень ярко светиться в рассеянных электронах и позволяют напрямую наблюдать взаимодействие клеток в тканях.

Вы продолжаете работу над другими методами?

Да, важное и перспективное направление — это контрастирование бактерий на любых поверхностях. Это более сложная методика: кроме редкоземельных элементов мы вводим и другие тяжелые элементы, происходят более сложные процессы последовательного замещения. Развитие и внедрение этого метода, а также его применений — сейчас актуальная задача. С его помощью можно, например, очень быстро оценить бактериальную обсемененность какой-то поверхности — быстрее, чем любым другим методом.

Лаборатория работает в структуре НИИ ГБ. А ведете ли вы совместные исследования с другими организациями?

Конечно! Например, метод контрастирования бактерий мы разрабатываем совместно с сотрудниками лаборатории микробиологии ФГАУ «Национальный научно-практический центр здоровья детей». Более того, на базе нашей группы постоянно действует референтный центр. Только за начало 2017 года было проведено более 50 съемок для сторонних организаций. Некоторые проекты пробные, а некоторые превращаются в интересные совместные проекты. В основном, это научные работы, а список объектов, которые попадали к нам в лабораторию, очень широк. Помимо клеточных объектов, часто приходится наблюдать весьма экзотические: от щитовидных желез голубей для Московской ветеринарной академии — до элементов вестибулярного аппарата летавших в космос виноградных улиток для Института Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН.

Микрофотография культуры клеток лимбального эпителия, сформировавших конфлюэнтный монослой. Изображение получено на СЭМ ZEISS EVO LS10 в режиме BSD (детекция обратно-рассеянных электронов) после контрастирования образца раствором хлорида неодима. Можно различить тонкие структуры, посредством которых клетки взаимодействуют между собой, ядра с ядрышками и округлые митохондрии в толще клеток

Да, наши разработки привели к созданию спин-офф компании для коммерциализации метода. Очень подробную информацию о методе и его возможностях можно найти на сайте bioree.ru. На данный момент мы довели этот метод до коммерческого продукта: комплекты для контрастирования биологических объектов и их изучения при помощи электронного микроскопа готовы к продаже. Можно также обратиться непосредственно в OPTEC — это наш коммерческий партнер, по методу лантаноидного контраста.