Атомно-силовая микроскопия Bruker в исследовании вируса гриппа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина Российской академии наук (ИФХЭ РАН), созданный в 1945 году, является одним из ведущих химических институтов Российской академии наук.

В институте проводят фундаментальные и ориентированные фундаментальные исследования по таким направлениям, как коллоидно-поверхностные явления и адсорбционные процессы, физикохимия нано- и супрамолекулярных систем, физико-химические проблемы коррозии и защиты от нее, электрохимия, защитные покрытия, кристаллизация, радиохимия и химия высоких энергий. В лаборатории биоэлектрохимии исследуются различные аспекты жизнедеятельности клеток. В частности, там проходят исследования молекулярных механизмов работы белок-липидных молекулярных машин, обеспечивающих протекание клеточного эндоцитоза, инфицирования клетки оболочечными вирусами, изучаются свойства и механизмы формирования липидных и липид-белковых нанодоменов, а также работа ионных каналов клетки.

Мы поговорили с Олегом Батищевым, заведующим лабораторией биоэлектрохимии Института физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН, об основных направлениях работы лаборатории.

Мы работаем с несколькими биологическими задачами. Одна из них касается исследования вируса гриппа и, в частности, самоорганизации белков, формирующих каркас вирусной частицы. Мы смотрим, как происходит проникновение вируса в клетку, какие процессы и изменения с его структурой и белками при этом реализуются. Если мы будем знать все эти молекулярные механизмы, то сможем искать способы, как их остановить, как подавить эти процессы.

В отношении вируса гриппа наша первая работа посвящена исследованию так называемого матриксного белка М1. Вирус гриппа можно сравнить с морским ежом: он сферический, и снаружи покрыт шипами. Причем внутри этого «ежика» содержится вирусный геном — то, что он должен доставить в клетку, чтобы она воспроизводила новые вирусы. Этот геном защищен двумя оболочками, белковой и липидной. Собственно, эта белковая оболочка как раз и сформирована из матриксного белка М1.

Чтобы произошло инфицирование, генетический материал должен выйти из вируса, и поэтому, с одной стороны, оболочки должны быть разрушены. С другой стороны, когда вирус начинает производить в инфицированной клетке дочерние вирусные частицы, все образующие их белки должны собраться на мембране клетки в строго определенной временной и пространственной последовательности. Возникает резонный вопрос: как эти процессы реализуются, и какими силами обеспечиваются? Мы пытаемся выяснить это в основном с точки зрения физических взаимодействий. Есть электростатические взаимодействия, есть гидрофобные взаимодействия, есть химические ковалентные связи. Какие именно силы влияют на изменение структуры белков так, что в одном случае они разрушаются, а в другом — собираются, как происходят эти процессы разрушения и самоорганизации? Атомно-силовая микроскопия — очень хороший метод для таких исследований, потому что он позволяет «глазами» увидеть, как идет процесс взаимодействия белков и их самоорганизация, а также как происходит разрушение белковых слоев. Подобные процессы и являются предметом наших исследований.

Другая перспективная тема с серьезными планами на будущее — с помощью силовых измерений увидеть, как происходит взаимодействие цельной вирусной частицы, допустим, закрепленной на зонде кантилевера, с клеткой или модельной мембраной. Это важно, потому что вирусное инфицирование начинается с взаимодействия с рецепторами, с активации поверхностных белков, которая приводит к слиянию мембран. Никто не знает, сколько белков должно участвовать в слиянии, какие силы они развивают, насколько сильные изменения должны при этом происходить со структурой вирусной частицы.

В отличие от вирусологов мы хотим показать, что процессы вирусного инфицирования с точки зрения физики общие для многих вирусов. Там работают силы одинаковой природы. Мы хотим понять общие физические законы, которые приводят к видоизменениям вирусных частиц на разных стадиях их жизненного цикла. В этих вопросах атомно-силовая микроскопия, на мой взгляд, также хороший метод. Она позволяет измерить силы, которые развивают отдельные молекулы. Но здесь есть и свои сложности, например, как закрепить вирус на зонде так, чтобы при этом увидеть все стадии работы белков? Несмотря на то, что у вируса поверхностных белков всего два, это остается сложной задачей, потому что происходит деформация самой частицы и линкера. Все детали необходимо просчитывать, учитывать и контролировать.

Процессы самоорганизации белкового каркаса вириона мы наблюдаем с помощью атомно-силового микроскопа MultiMode V c контроллером NanoScope IV. Этот прибор позволяет нам работать в жидких средах, что крайне важно для биологических объектов, причем с достаточно высоким разрешением. Мы используем новые острые зонды модели SNL, чтобы увеличить разрешение. Причем работать с биологическими объектами необходимо в жидких средах, т. е. в условиях, максимально приближенных к условиям живой клетки. В жидкости они также работают достаточно хорошо.

Когда мы хотим посмотреть, как происходит организация белкового слоя, в идеале нужно видеть отдельные молекулы. Очень важно понимать, как они ложатся, есть ли между ними какая-то кластеризация, образуют ли они плотные островки или это просто хаотичное расположение на поверхности? Есть ли какие-то кооперативные силы, которые способствуют образованию белкового слоя? Например, если одна молекула села на поверхность мембраны, будет ли она притягивать другие, или они сначала случайно расположатся, а потом какой-то другой механизм соберет их в одной области. Именно поэтому атомно-силовая микроскопия имеет здесь больше преимуществ, поскольку она позволяет визуализировать отдельную белковую молекулу. Более того, атомно-силовые микроскопы компании Bruker позволяют изучать кинетику адсорбции, чего другие методы на таком уровне дать не могут. Можно увидеть степень заполнения поверхности в зависимости от времени. Кроме атомно-силовой микроскопии я не знаю другого метода, который может показать такие результаты.

Результатом наших исследований может стать создание лекарств — не лекарственных вакцин, а именно лекарств от вирусов. Обычно от момента понимания фундаментальных механизмов до создания лекарства проходит около 20 лет. Сегодня мы близки к пониманию фундаментальных механизмов.